**印跡的基本原理、實驗步驟

Western Blot原理

       Western Blot（**印跡）采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。SDS-PAGE可對蛋白質樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質才能與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，這樣清洗除去未結合的一抗后，只有在目標蛋白的位置上結合著一抗。用一抗處理過的NC膜再用標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。
       Western Blot實驗試劑及儀器
       1.試劑準備
      （1）甲醇
      （2）轉移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）
      （3）一抗，二抗
      （4）PBST，PBS，Tween-20
      （5）顯影液（5X）：
       自來水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中）
       米吐爾 1.55g， 亞硫酸鈉（無水） 22.5g， 碳酸鈉（無水） 33.75g， 溴化鉀 20.95g，補水至 500ml
      （6）定影液：
       自來水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）
       硫代硫酸鈉 240g， 亞硫酸鈉（無水） 15g， 冰乙酸 12.6ml，硼酸 7.5g，鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時再加入），加水定容至 1000ml，室溫保存
       2. 材料準備
       轉膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支滴管，兩張濾紙，一張PVDF膜，轉膜槽，轉移電泳儀，搖床，計時器，磁力攪拌器，轉子，Western blot 盒，一塊SDS-PAGE膠，脫脂奶粉
       實驗步驟

       1.將玻璃板洗凈，*后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 
       2.分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡），加入10%AP及TEMED即可。 
       3.封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS，封膠后靜置至膠凝固。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力**殘留水滴。
       4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時防止氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正。30min后上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。(10%的AP*好現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，*好棄掉) 

       (二) 樣品處理 
       培養的細胞（定性）  
       1.去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 
       2.對于6孔板來說每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 
       3.刮下的細胞在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。 
       4.用干凈的針尖挑絲，將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，可將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 
       5.待樣品恢復到室溫后上樣。 
 
        培養的細胞（定量）  
       1.去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 
       2.加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。 
       3.刮下的細胞收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。 
       4.12000g離心，4℃，2min。 
       5.取少量上清進行定量。 
       6.將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣*好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。 
       3. 組織  
       1.心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 
       2.12000g離心，4℃，2min。 
       3.取少量上清進行定量。 
       4.將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣*好，低溫儲存剩余溶液（溶于1×loading buffer），每次上樣前98℃，3min。 
 
       (三) SDS-PAGE電泳(不用染色)  
       使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。關于SDS-PAGE實驗操作原理及FAQ參考  

       (四) 轉膜

       電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備  
       1、準備：轉移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）、轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜。 
       2、剪切濾紙和膜時一定要戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉膜前，PVDF膜應在甲醇溶液中浸泡5-10秒，浸濕為止，在平衡液中平衡（甲醇的作用是固定大分子蛋白，使小分子物質易轉移出去） 
       3、將轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜浸泡在轉移緩沖液中，然后取出SDS-PAGE膠，將濃縮膠輕輕刮去，并在膠的一角做一缺角作為標記以區分上樣順序。將膠在轉膜緩沖液中浸泡5min左右，以平衡離子強度。 
       4、夾子打開平放底部黑色電極(陰極)，放一張海綿墊片，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。在海綿墊片上放置1張轉移緩沖液浸泡過的濾紙，對齊，然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時可滴加轉膜液潤濕。取出浸在轉膜液中的凝膠平放在濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，玻棒來回搟幾遍排除所有氣泡，注意在膜的正面作上標記（可以將膜的一角剪去或用簽字筆在膜的邊角上做記號）。在膜上蓋一張轉移緩沖液浸泡過的濾紙，同樣須確保不留氣泡。*后蓋上另一張海綿墊，蓋上陽極板（白色），夾緊。保證對凝膠有一定壓力。 
       5、將夾子放入轉移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。轉膜時將轉移槽放入冰水中進行。轉膜過程中電轉液用磁力攪拌器攪拌。一般用恒壓110V轉移60min。對于大分子量的蛋白（超過120KD），時間約80min。特別要注意加強降溫措施。 
       (五) **學檢測 
       1、 取膜，將膜正面朝上在1xPBST溶液中搖動五分鐘，洗一次，移至含有封閉液（含10％脫脂奶粉的 瓶PBST 緩沖液；脫脂奶粉5g，PBST 100ml，溶解后 4℃保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1小時。注：10%脫脂牛奶的作用：用大分子物質封閉非相關的蛋白結合位點，降低非特異性結合（抗體與膜），同時也使背景色不高。PBST：T為吐溫，減少非特異性吸附，不影響抗體抗原的結合。 
       2、 取出膜在1xPBST溶液中洗5分鐘，搖動，洗兩次，放入1xPBST緩沖液中（內含5%脫脂牛奶），同時加入一抗與二抗到緩沖液中，孵育60min。 
       3、 用1xPBST洗至少三次，5min/次 
       4、 化學發光，顯影。顯影液與水1:4，定影液與水1:9，發光液 
       注：顯影液（5X）： 
       自來水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中） 
       米吐爾 1.55g 
       亞硫酸鈉（無水） 22.5g 
       碳酸鈉（無水） 33.75g 
       溴化鉀 20.95g 
       補水至 500ml 
       配制時，上述藥品應逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4℃保存。使用時用自來水稀釋至 1 倍。 
       定影液： 
       自來水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者） 
       硫代硫酸鈉 240g 
       亞硫酸鈉（無水） 15g 
       冰乙酸 12.6ml 
       硼酸 7.5g 
       鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時再加入） 
       加水定容至 1000ml，室溫保存 
       發光液：魯米諾試劑2ml、過氧化氫1.3ml 

       5、 在暗室中，將 1×顯影液（50ml）和定影液（50ml）分別到入塑料盒中；在紅燈下取出 X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大 25px）；打開 X-光片夾，將膜放入X-光片夾，并將發光液均勻涂抹在膜上，之后把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上 X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為 1min 或 5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達*佳效果；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為 1～2min（20～25℃），溫度過低時（低于 16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時間一般為 5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

       (六) 注意事項  

       1.顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產生影響。 

       2.一抗，二抗的孵育時間因抗體不同可做適當的調整。 
       3.轉膜時濾紙與膠，膠與膜，膜與濾紙之間不能有氣泡，必須用玻棒搟走。有氣泡會影響轉膜效果。 
       4.把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動