**印跡在實(shí)驗(yàn)的過程中常出現(xiàn)的問題
**印跡在實(shí)驗(yàn)的過程中常出現(xiàn)的問題
**印跡在實(shí)驗(yàn)過程中常出現(xiàn)的問題：
1. Western blot結(jié)果中的背景為什么較高?
可能的原因及建議
5.檢測時(shí)曝光時(shí)間過長——減少曝光時(shí)間。
2. Western blot結(jié)果中雜帶較多
可能的原因及建議
1.目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小。
7.一抗或者二抗?jié)舛绕摺档?a href="http://v5nr.com/klbscience_Product_2028646940.html" class="keyword_inherit" name="keyword_inherit" target="_blank">抗體濃度。
3. Western blot結(jié)果中無信號或顯示信號弱
4. 其它現(xiàn)象：
3.蛋白分子量偏低或偏高——膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
5. TBS與PBS的區(qū)別
Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。
6. Western是否可以同時(shí)加兩種或者多種一抗
通常情況下只加一種種一抗。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。
7. PVDF與NC膜的區(qū)別
NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性較PVDF膜差，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。
8. Western一抗的選用
理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價(jià)格偏高，所以一般來說多抗足夠了。
9. Western抗體和ELISA抗體的區(qū)別
做**印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶。
10. “短路”現(xiàn)象的產(chǎn)生和處理
如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， *后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。
11. Western Blot的染色
可以在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因?yàn)榧状寄茉黾拥鞍踪|(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，同時(shí)可以延長高分子量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；選用上等的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。
13. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理
DAB顯色在辣根過氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。
14. 酶顯色與熒光顯色的優(yōu)缺點(diǎn)
1.膜封閉不夠——延長封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。
2.一抗稀釋度不適宜——對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇*適宜的抗體稀釋度。
3.一抗孵育的溫度偏高——建議4℃結(jié)合過夜。
4.膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過——實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤。
2.目的蛋白有其它剪切本——查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。
3.樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解——加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。
4.上樣量過高，太敏感——適當(dāng)減少上樣量。
5.一抗特異性不高——重新選擇或制備高特異性的抗體。
6.一抗不純——純化抗體
可能的原因及建議
1.檢測樣本不表達(dá)目的蛋白——選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。
2.檢測樣本低表達(dá)目的蛋白——提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
3.轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移——可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
4.抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白——購買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白。
5.一抗孵育時(shí)間不足——建議4℃結(jié)合過夜。
6.二抗與一抗不匹配——選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
7.洗膜過度——洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。
1.膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑——抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
2.反白（條帶顯白色）——目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?nbsp;
PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽離子緩沖液優(yōu)選TBS；陽離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液則優(yōu)選PBS。
PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格較昂貴。
一般來說用于western的抗體主要識別氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。
1.陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
2.膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。
3.生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
12. 大分子量蛋白轉(zhuǎn)移效率低的解決方法
**酶技術(shù)就是用酶標(biāo)記已知抗體(或抗原)，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)并結(jié)合，結(jié)合形成的復(fù)合物中所含有的酶分子遇到底物時(shí)，會催化底物水解、氧化或還原，從而發(fā)生顯色反應(yīng)。**酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的**反應(yīng)，稱為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。
**熒光技術(shù)中的熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，但**酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記**酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于**熒光法。酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進(jìn)行**電鏡觀察。
