細胞實驗技術及基本知識

一．細胞培養(yǎng)技術

細胞周期的測定

一、原理

    細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使*終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計**、二、三、四細胞期分裂指數。

9、計算： 細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。

  （2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉?2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

細胞的凍存和復蘇

一、原理

   在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞*易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

二、操作步驟

（一）凍存

1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數，調整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時應小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時補充，**不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復蘇

1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。

3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，**天觀察生長情況。

三、試劑和器材

器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等

試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）

附：凍存液配制：

培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。

細胞系或細胞株的建立

一、概念

    1、細胞系（Cell Line）：原代培養(yǎng)舞經**傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系（Lineage of Cells）所組成。

    2、細胞株（Cell Strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數有限，稱為有限細胞株（finitecell strain）；如果可以連續(xù)傳代，稱為連續(xù)細胞株（continuous cell strain）。對于人類腫瘤細胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

   二、建立細胞系（或株）的要求

   什么樣的體外培養(yǎng)群可被認可為己鑒定的細胞，視具體情況而定，無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長期培養(yǎng)，特別是反復傳代的細胞，常需做如下說明：

   1、組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；

                個體性別、年齡；取材的器官或組織。

                如系腫瘤組織，應說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。

   2、細胞生物學檢測：

   了解細胞一般和特殊的生物學性狀，如細胞一般形態(tài)，特異結構，細胞生長曲線和分裂指數，倍增時間，接種率等。

   如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。

   3、培養(yǎng)條件和方法；應說明細胞系（或株）適應的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。

   三、若干細胞建株的要點及基本過程

   （一）腫瘤細胞培養(yǎng)技術要點

   1、取材：材料主要來源于外科手術或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉移**結或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。

   2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養(yǎng)時能與瘤細胞同時生長，并常壓過癌細胞，導致癌細胞生長受阻以至消失，應仔細排除。

   排除方法常有：機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

   3、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率

   根據實驗經驗，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養(yǎng)后，要經過對新環(huán)境的適應才能生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌**等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。

  （二）人類**母細胞建株方法

   l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。

   2、混勻后沿管壁緩慢加到預置有4ml**細胞分離液的液面上靜置30min。

   3、1500rpm，15min，吸取白細胞層（**層）于另一離心管中。

   4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。

  5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混勻。

   6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。

  7、1500rpm，15min。將細胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37℃培養(yǎng)。

   8、5天后觀察細胞轉化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l—2次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。

   9、待轉化細胞數量明顯上升，并出現(xiàn)細胞團塊后，可轉入25ml細胞培養(yǎng)瓶中，加1—2ml培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10—15天，一般每隔3—4天觀察一次，決定是否換液，傳代。

   10、細胞生長達一定數量后凍存，凍存前應進行核型分析和存檔。

個別組織細胞的培養(yǎng)

體內組織細胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細胞培養(yǎng)的要點如下:

一、上皮細胞培養(yǎng)

   上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關鍵。

   體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

   以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

   1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

   3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

   4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

   5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

   6、反復吹打，制成懸液。

   7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

   8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

   二、內皮細胞培養(yǎng)

內皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內皮****、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

研究人內皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法*為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。

三、神經膠質細胞培養(yǎng)

   神經細胞（神經元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經

組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉化。

養(yǎng)方法如下：

1、從手術室無菌取腦髓灰質或白質后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復吹打即制成細胞懸液。

3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細胞成分。

4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網成紗布過濾，計數并調整細胞密度。

5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

該細胞適應環(huán)境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內也可能不見細胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態(tài)。細胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

四、肌組織培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實用。

（－）骨骼肌細胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過。

3、計數調整細胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5、培養(yǎng)基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。

  接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見到收縮現(xiàn)象。

（二）心肌細胞培養(yǎng)

  心肌細胞是*早的培養(yǎng)材料，Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，*常用的是雞胚心肌。

  心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

五、巨噬細胞培養(yǎng)

巨噬細胞屬**細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞**和分子**學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

  培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法*為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。

9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

六、腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank’s液的無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網，濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不銹鋼篩網，輕輕濾過，Hank’s液洗滌1次，收集網上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個/cm2，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，形態(tài)學觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約100μm。

七、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細胞。

二．細胞培養(yǎng)的基本內容

常用設備

準備室的設備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未**物品）、儲品柜（放置**過的物品）、包裝臺。

配液室的設備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養(yǎng)室的設備：

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧****機、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。

無菌操作

無菌室的**：

1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）**：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射

3.實驗前**：打開紫外燈、三氧**機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘

4.實驗后**：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

實驗人員的無菌準備：

1.肥皂洗手。

2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋

3.用75％酒精棉球擦凈雙手。

無菌操作的演示：  

1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過火**

4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和**

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自來水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次，*后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和**閥，當蒸氣成直線上升時，關閉**閥，當指針指向15磅時，維持20-30分鐘。

7.高壓**后烘干

二、舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于**儲存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和**閥，隨著溫度的上升**閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關閉**閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向15磅時，調節(jié)電開關維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶**前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因為高壓**后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。

金屬器械洗消：

  金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓（30分鐘）**，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序：

1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘**，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。

2. 膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內高壓**，烘干備用。

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內高壓**，烘干備用。

4. 膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：

6.其他**方法：有的物品既不能干燥**，又不能蒸氣**，可用70％酒精浸泡**。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下**。也可用氧化乙烯**塑料制品，**后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線**塑料制品效果*好。

為了防止清洗器材已**與末**發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否**。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC12?6H2o)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。

注意事項：

1.嚴格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓**時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓**效果。檢查**閥是否通暢，以防高壓時爆炸。

2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。

3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。

細胞培養(yǎng)用液的配制與**

器材與試劑：

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟：

一. 水的制備：

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

二.PBS的制備與**(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內待**：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內8磅**20分鐘。注意高壓**后要用**蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制與**：

  胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力*強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。

2.用注射濾器抽濾**：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾**。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

四.青、鏈霉素溶液的配制于**

1.     所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘**。

2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml**雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml**雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度*終為100單位/ml。1單位＝1微克？

五.RPMI1640的制備與**：

1.溶解、調PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度*終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。*后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待**。

3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾**。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。

4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。

5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。

六．血清的滅火：

細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

七.HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾**，分裝后4℃保存。

注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾**后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長**甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾**，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中*終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾**，分裝小瓶，保存溫度為?? ℃ 。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（**可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和****。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾**。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml內皮生長因子，

注意事項：

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值*終為7.2，可在配制時調PH至7.4。

細胞傳代培養(yǎng)（消化法）

具體操作：

一. 傳代前準備：

1.預熱培養(yǎng)用液：把已經配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

  5.準備好將要使用的**后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次**。

6.取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

  7.從培養(yǎng)箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

  8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口**。

二.胰蛋白酶消化；

  1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞*好，*佳消化溫度是37℃。

  2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

  3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

三.吹打分散細胞：

1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。

   4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

四.分裝稀釋細胞：

   1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

   2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。*后要做好標記。

五.繼續(xù)培養(yǎng)：

   用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。

傳代細胞培養(yǎng)注意事項：

  1.嚴格的無菌操作

   2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓**，使用時調節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時細胞容易脫壁。

細胞的復蘇

細胞復蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體操作

一. 實驗前準備：

1.將水浴鍋預熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

  3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二．取出凍存管：

  1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

  2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

三．迅速解凍：

  1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

  2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

四.平衡離心：

   用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min

五.制備細胞懸液：

   1.吸棄上清液。

   2.向離心管內加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。

六.細胞計數：

  細胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細胞

  將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。

細胞計數

實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

具體操作：

一.準備工作：    

   取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。

二.細胞懸液制備：

細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。

三.細胞計數：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。

  2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。

  3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

  4.統(tǒng)計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現(xiàn)計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。

  5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝          （ 四個大格子細胞數/4)         ×2×104

說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。

公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

四.細胞計數要點：

  1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；

  2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

  3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

  4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

  5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

五.初學者易犯的錯誤：

  1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

  2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

  3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實驗特殊試劑的配制：

4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。

細胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1.使用DMSO前，不需要進行高壓**，它本身就有**的作用。高壓**反而會破華它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時*好戴上手套操作。

2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內，是“危險溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。